• Туберкулез - это заболевание инфекционно-аллергического генеза, вызы Современная эпидемическая ситуация по туберкулезу в России имеет следующие особенности:

     
    • поздняя диагностика туберкулеза, обусловленная недостаточным охватом населения регулярным диспансерным и флюорографическим обследованием;
    • изменение типичной клинической картины заболевания;
    • изменения биологических свойств возбудителя туберкулеза, требующие нетрадиционных подходов для его обнаружения и идентификации.
    В таких условиях классическая диагностика туберкулеза легких в ряде случаев становится затрудненной. Еще более проблематичной является диагностика внелегочного туберкулеза, при проведении которой на фоне широчайшего полиморфизма клинических проявлений приходится сталкиваться со следующими трудностями:
    • малая частота обнаружения возбудителя в исследуемом материале;
    • неэффективность использования рентгенологических и гистологических методов на начальных стадиях заболевания;
    • наличие локализаций и форм туберкулеза, при которых проведение бактериологических, рентгенологических и гистологических исследований не эффективно (собственно туберкулез глаз, туберкулезпо-аллергические поражения глаз, туберкулезно-аллергические синовиты) [2].

    При диагностике туберкулеза врачи зачастую встречаются со значительными трудностями, так как заболевание начинается без специфических клинических и лабораторных признаков. Опытному фтизиатру легче разобраться с клиникой туберкулеза, однако впервые такие больные обращаются к участковому врачу. Заподозрив туберкулез, участковый врач направляет больного в учреждения фтизиатрической службы. Тем не менее и в амбулатории, и в стационаре терапевтам, инфекционистам, хирургам, офтальмологам, гинекологам и врачам других специальностей в ряде случаев приходится заниматься дифференциальной диагностикой, чтобы исключить туберкулез или передать больного для углубленного обследования фтизиатрам.

    У больных ВИЧ-инфекцией туберкулезные поражения выявляются в 500 раз чаще, чем у всего населения, однако клинические и рентгенологические характеристики туберкулеза на фоне ВИЧ-инфекции часто атипичны.

    Наиболее важными в диагностике туберкулеза являются рентгенологмческле методы. Вместе с тем в распознавании этого сложного вида инфекционной патологии помогают клиницистам и методы лабораторно-иммунологического обследования. В первую очередь это относится к бактериологическим методам этиологической диагностики - бактериоскопия и посев материала на элективные среды. Применение этих методов в виде скрининга в группе лиц, страдающих кашлем с выделением мокроты, но считающих себя здоровыми, позволяет выявлять от 0,25 до 7,6 больных туберкулезом из 1000 обследованных. Ввиду методического несовершенств и высокой стоимости еще не введены в широкую практику молекулярно-генетические методы выявления возбудителя туберкулеза - полимеразной цепной реакции и ДНК-зондов. Вместе с тем названные методы весьма информативны.

    ЭТИОЛОГИЯ

    Туберкулез у человека вызывается в основном (92% случаев) микобактериями туберкулеза (Мyсоbacterium tuberculosis) и реже - микобактериями бычьего типа (Мyсоbacterium bovis). Резервуаром М. tuberculosis является человек, М. bovis - животные. Возможна передача микобактерий бычьего типа от человека человеку.

    Микобактерии туберкулеза имеют форму тонких прямых или слегка изогнутых неспорообразующих палочек. Тела палочек гомогенные или зернистые с невыпукло закругленными концами длиной 1-10 мкм, шириной 0,2-0,6 мкм. Микобактерии туберкулеза являются облигатными аэробами, факультативными внутриклеточными паразитами. Размножаются сравнительно медленно - одно деление за 12-20 ч. На плотных питательных средах (in vitro) рост микобактерий наблюдается в виде морщинистого или суховатого чешуйчатого налета.

    Значительным изменениям подвержены как морфологические и тинкториальные, так и антигенные, вирулентные и другие свойства микобактерий туберкулеза [4]. Благодаря такой изменчивости возбудитель выживает в организме человека и длительно, иногда на протяжении всей жизни, персистирует в нем.

    ОТДЕЛЬНЫЕ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗА

    Патогенез туберкулеза очень сложен и недостаточно изучен, у ученых нет общего мнения о полной картине развития заболевания. Поэтому мы остановимся на отдельных патогенетических особенностях туберкулезного процесса, которые необходимо учитывать при проведении лабораторной диагностики этого заболевания.

    Инфицированность населения микобактериями туберкулеза к 25-летнему возрасту, по данным различных источников, достигает 73-97% (в Санкт-Петербурге-80%), но у подавляющего большинства инфицированных людей заболевание не развивается, во всяком случае, его клинически выраженные формы. Сдерживание развития активного процесса обеспечивается формированием инфекционного иммунитета.

    Микобактерии могут поражать все органы и системы организма, при этом происходит образование специфических гранулем. Наиболее частой локализацией туберкулезного процесса являются легкие, но в последние годы отмечается увеличение заболеваемости внелегочным туберкулезом, диагностика которого представляет наибольшие трудности.

    Попадают микобактерий в организм человека с вдыхаемым воздухом, через поврежденную кожу, слизистые оболочки, алиментарным путем. Внутриутробное заражение возможно через плаценту. Дополнительное инфпцирование желудочно-кишечного тракта происходит при проматывании мокроты, содержащей микобактерий.

    Размножается возбудитель туберкулеза внутри макрофагов, которые фагоцитируют микобактерий, но фагоцитоз остается незавершенным. Происходит это в результате воздействия фермента, нарушающего слияние фагосомы с лизосомой. При первичном инфицировании легких в течение первой недели до 50% макрофагов содержит Микобактерии туберкулеза, при этом каждая клетка в свою очередь становится источником бацилловыделения. В результате незавершенного фагоцитоза не только сохраняется жизнеспособность патогена, но и иммунная система не получает информации об его антигенных свойствах, так как макрофаг является антигенпрезентирующей клеткой - подготавливает антигены патогена и представляет их другим клеткам иммунной системы для формирования защитной реакции. При вторичном инфицировании в условиях сформированного иммунитета большинство бактерий успешно разрушается, и только 3% макрофагов содержит микобактерий туберкулеза. С макрофагами микобактерий попадают в регионарные лимфатические узлы. Из лимфатических узлов легких микобактерий через грудной проток попадают в кровь и с кровью распространяются по всему организму.

    Специфичной для туберкулеза местной морфологической реакцией (очагом продуктивного воспаления) является туберкулезная гранулема (tuberculum - бугорок). В центре очага находится участок творожистого некроза (казеоза), вокруг которого расположены гигантские (многоядерные) клетки Пирогова-Лангханса и эпителиоидные клетки. Кроме того в гранулеме имеются лимфоидные и плазматические клетки, на периферии - фибробласты.

    В легких и других обсемененных органах и тканях может произойти заживление пораженных участков, часто сопровождающееся кальцинацией, хорошо видной на рентгенограммах.

    Однако такие участки и течение всей жизни инфицированного остаются потенциальным источником реактивации туберкулезного процессa. Обратный процесс - диссеминация может привести к милиарному туберкулезу или туберкулезному менингиту с высоким риском тяжелого течения и летального исхода, особенно у новорожденных и детей младшего возраста [3].

    При нормальной реакции иммунной системы на микобактерии туберкулеза через 4-8 нед после инфицирования (БЦЖ-вакцинации) формируется нестерильный клеточный иммунитет, опосредованный Т-лимфоцитами. Его наличие можно проверить постановкой туберкулиновых проб, в ответ на которые в инфицированном организме развивается реакция гиперчувствительностн замедленного типа, являющаяся по сути аллергической реакцией.

    В результате первичного заражения М. tuberculosis у инфицированных развивается первичный туберкулез, который в начальной фазе характеризуется неразвитой иммунной реакцией, параспецифическими и обширными перифокальными реакциями, тропностью к генерализации процесса (диссеминации), позднее, при формировании иммунитета,- вероятным самоизлечением.

    Вторичный туберкулез формируется в результате повторного заражения М. tuberculosis и/или реактивации старых очагов и характеризуется локальным поражением, в пределах органа (чаще - легкого), и проявляется в виде очага или инфильтрата (в результате распада ткани - каверны).

    Патогенетические особенности туберкулезного процесса и характеристики М. tuberculosis определяют направления и перечень лабораторно-диагностических исследований при туберкулезе.

    КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА

    История лабораторной диагностики туберкулеза берет начало с середины XIX века. Первое гистологическое исследование специфической гранулемы было выполнено в 1852 г. выдающимся хирургом Н. И. Пироговым. Он описал гигантские клетки, содержащиеся в туберкулезном бугорке (многоядерные клетки Пирогова-Лангханса). Этиологическую лабораторную диагностику туберкулеза впервые осуществил немецкий бактериолог Роберт Кох в 1882 г. открывший возбудителя этого заболевания.

    Исследование кожной чувствительности к микобактериям туберкулеза было предложено австрийским патологом и педиатром Клеманс фон Пирке в 1907 г. Для проведения накожной пробы он использовал туберкулин Коха - препарат, содержащий антигенный материал микобактерии туберкулеза (Р. Кох получил в 1890 г. водно-глицериновую вытяжку туберкулезных культур, названную туберкулином, и предложил использовать ее для лечения туберкулеза).

    В настоящее время для лабораторной диагностики туберкулеза применяется целый ряд информативных методов, так как по причине изменчивости возбудителя и патогенетических особенностей инфекционного процесса во многих случаях невозможно получить однозначное лабораторное заключение в результате применения только 1-2 методов. На рис. 19.1 представлены некоторые лабораторно-иммунологические исследования, выполняемые при проведении первичной диагностики туберкулеза.

    Все методы лабораторной диагностики туберкулеза можно разделить на специфические (этиологические) и неспецифические.

    А. Специфические методы лабораторной диагностики туберкулеза

    В свою очередь специфические методы по видам исследований можно разделить на несколько групп. Бактериологические и молекулярно-генетические методы являются основным инструментом в лабораторной диагностике туберкулеза, они позволяют определять в организме больного присутствие возбудителя туберкулеза. Если бактериовыделение не удается выявить, а клинически исключить туберкулез не представляется возможным, могут быть использованы цитогистологические методы, с помощью которых можно обнаружить специфические туберкулезные изменения (элементы гранулемы).

    С помощью иммунологических методов можно оценить реакцию иммунной системы на микобактериальные антигены и определить уровень специфических антимикобактериальных антител, что в комплексе с результатами других исследований является важной диагностической информацией. Например, при обследовании детей наиболее информативными являются иммунологические методы (реакция Пирке, проба Манту, определение специфических антимикобактериальных антител методом ИФА).

    Специфические методы лабораторной диагностики туберкулеза делятся на 4 группы:
    1. Бактериологические методы:
      • бактериоскопия [показать]

    Стандартной методикой является окраска препарата по Цилю-Нильсену карболфуксином с последующей микроскопией при 1000-кратном увеличении. Эта методика должна выполняться в условиях клинических лаборатории, начиная с уровня поликлиник, и входит в поликлинический и клинический минимум обследования пациента, страдающего кашлем с мокротой (3-кратное микроскопическое исследование мокроты на микобактерии туберкулеза). Бактериоскопия мокроты должна проводиться и больным хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также работникам неблагополучных по туберкулезу животноводческих хозяйств.

    При обнаружении в мазке в одном поле зрения 5 и более микобактерии вероятность получения положительного результата посева материала на питательные среды значительно возрастает.

    Метод люминесцентной микроскопии основан на способности липидов микобактерии туберкулеза связывать флюоресцентные красители, которые светятся под воздействием коротких синих и ультрафиолетовых лучей.

    Микроскопия при неиммерсионном 100-кратном увеличении позволяет видеть микобактерии в препарате, окрашенном флюоресцентным красителем аурамином-родамином.

    При помощи метода люминесцентной микроскопии дополнительно, по сравнению с возможностями обычной бактериоскопии, можно выявить микобактерии туберкулеза в 17% случаев исследования нативных мазков и в 8% случаев исследования мазков из флотационных колец.

    Большая контрастность микроскопической картины дает возможность проводить исследования при малых увеличениях, что, значительно расширяя поле зрения, позволяет выявить единичные микобактерии и, таким образом, делает метод особенно ценным при исследовании олиго-бациллярного материала [14].

    Метод микроскопического исследования кислотоустойчивых мазков с окраской аурамином О или по Цилю-Нильсену позволяет быстро получить результаты, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью. Частота выявления микобактерии у больных туберкулезом при микроскопии мокроты составляет, по данным разных авторов, от 48 до 87%, а плевральной жидкости - до 2%. При этом сравнение данных микроскопических исследований с данными культуральных исследований показывает, что доля ложноположительных результатов составляет до 6%. При исследованиях материала из очагов внелегочной локализации чувствительность и специфичность метода микроскопии еще ниже.

  • посев на питательные среды [показать]

    Данные культуральных исследований более информативны, чем бактериоскопических методов, но получить ответ о наличии возбудителя туберкулеза можно лишь через несколько недель.

    Посев мокроты на классические элективные среды (Левенштайна - Йенсена и др.) входит в перечень методов, выполняемых бактериологическими лабораториями. Рост первых колоний отмечают через 4-8 нед. Использование современных высокоселективных сред позволяет получать культуры в течение 1-2 нед, однако идентификация требует дополнительного времени. При идентификации микобактерии весьма информативен метод определения термостабильности каталазы микобактерии, так как указанным свойством обладают только М. tuberculosis и М. bovis.

    Кроме мокроты материалом как для мазка, так и для посева является аспират желудочного содержимого, взятый натощак рано утром. Однако частота находок составляет 4-5%. В мокроте у этих же больных выявление микобактерии в 6-10 раз чаще.

    Современные бактериологические методы выявления микобактерии туберкулеза в исследуемом материале, к сожалению, характеризуются невысокой чувствительностью.

    Метод хроматографии миколовых кислот является дополнением к культуральным исследованиям.

  • биологический метод [показать]

    До появления молекулярно-генетических методов биологический метод считался наиболее чувствительным. Однако, в случаях, когда в исследуемом материале содержатся микобактерии, высоко устойчивые к препаратам изоникотиновой кислоты, не всегда удается получить развитие генерализованного туберкулеза, так как такие микобактерии иногда оказываются невирулентными или маловирулентными для морских свинок.

    Современные культуральные и молекулярно-генетические методы считаются достаточно информативными, поэтому биологические пробы с заражением морских свинок являются неперспективными.

  • Молекулярно-генетические методы [показать]

    Применение молекулярно-генетических методов для определения микобактерии в клинических образцах позволяет в короткие сроки осуществлять диагностику туберкулеза. Быстрота определения имеет особое значение в случаях идентификации штаммов микобактерии, отличающихся замедленным ростом. Молекулярно-генетические методы имеют неоспоримое превосходство над культуральными в случаях, когда в образце содержатся нежизнеспособные и/или некультивируемые микобактерии.

    Применение системы ВАСТЕС с использованием ДНК-зондов позволяет в 2-4 раза, по сравнению с культуральным методом, сократить время, необходимое для выявления микобактерии туберкулеза. Но наиболее перспективным для применения в практических лабораториях оказался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий проводить идентификацию микобактерии туберкулеза в клинических образцах в течение 48 ч.

    Метод ПЦР основан на ферментативной амплификации специфических участков генома микобактерии туберкулеза и дальнейшей детекции и идентификации полученных ампликонов. Аналитическая чувствительность метода составляет от 1 пкг до 5 фг микобактериальной ДНК в образце, что эквивалентно выявлению единичных (1-10) клеток.

    В настоящее время разработаны и используются системы для амплификации следующих участков генома микобактерии туберкулеза: области последовательности IS 6110, гена, кодирующего белок теплового шока массой 65 кДа, фрагмента гена МРВ64 и гена 165 рРНК, гена белка массой 70 кДа.

    Оценка различных систем амплификации показала, что чувствительность метода составляет от 80 до 97%. С помощью метода прямой амплификации рРНК микобактерии туберкулеза выявляют в 96,3% клинических и в 97,7% культуральных образцов. Совместное использование в ПЦР-анализе двух или трех систем амплификации позволяет повысить чувствительность определения до 98%. При исследовании 3 образцов от пациента чувствительность метода может достигать 100%.

    Метод ПЦР позволяет проводить избирательную амплификацию фрагментов нуклеиновых кислот, строго специфичных только для бактерии mycobacterium tuberculosis, поэтому специфичность ПЦР-анализа микобактерий туберкулеза может составлять до 100%.

    Анализ образцов мокроты от пациентов с симптомами легочного туберкулеза, проведенный с использованием коммерческих тест-систем "Amplicor" фирмы "Hoffman-La Roche" (Швейцария) и "MTD-Amplified Direct Test" фирмы "Gene-Probe" (Швейцария), показал результаты, представленные в табл. 19.1.

    Таблица 19.1. Характеристика диагностических тест-систем Amplicor и MTD-Amplified Direct Test [9]

  •  



  • На главную